己烯雌酚(stilbestrol)是人工合成的非甾体雌激素物质，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。主要用于雌激素低下症及激素平衡失调引起的功能性出血、闭经，还可用于死胎引产前，以提高子宫肌层对催产素的敏感性。孕妇服用此药，其女性后代在青春期后宫颈和阴道的腺病及腺癌发生率升高，男性后代生殖道异常和精子异常发生率也增加。己烯雌酚可导致恶心，呕吐，食欲不振，头痛等症状，长期使用可使子宫内膜增生过度而致子宫出血和肥大。
国标中规定了在牛猪肝肾和肌肉组织中己烯雌酚方法检出限为1.0μg/kg。
(1) 样品提取
称取5.00g(精确到0.01g)均质好的样品，置于50.0ml离心管中，加入15.00ml 叔丁基甲基醚，涡旋1 min，振荡10min，在-4℃下以 6000rpm离心5min，取上清液转入浓缩瓶中；用15.00ml叔丁基甲基醚再提取一次，合并提取液，45℃水浴中减压旋蒸浓缩至干。加80%乙腈溶液2ml于浓缩瓶中，涡旋溶解残留物，然后将其转移至10ml离心管中；再加入正己烷5ml于浓缩瓶中洗涤，一并转移至离心管中，震荡混合1min，在15℃以6000rpm离心10min，弃去上清液。再加正己烷5ml于离心管中同法操作，留下层备用。
(2) 净化方法
先将cleanert pep-2 (500mg/6ml)小柱用3ml叔丁基甲基醚、3ml甲醇和3ml水活化平衡，取上述下层溶液，以每3~4秒1滴的流速通过预处理后的固相萃取柱；先用甲醇:水(3:7，v/v)溶液3ml冲洗，然后加水3ml平衡，再用甲醇:2%氨水(1:9, v/v)溶液3ml冲洗，弃去洗液，抽干。用0.1%甲酸/甲醇:叔丁基甲基醚(1:9，v/v)溶液7ml洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用80%乙腈水1ml溶解残余物，充分涡旋，过0.22μm滤膜，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
(3) 检测方法
3.1 色谱条件
色谱柱：venusil mp c18，2.1×50mm，2.5μm，100å；
流动相：a相-水，b相-乙腈
柱 温：35℃；
进样量：5μl；
梯度洗脱：见表1
时间(min) | 流速 (ml/min) | a/% | b/% |
0 | 0.35 | 85 | 15 |
1.5 | 0.35 | 85 | 15 |
4 | 0.35 | 10 | 90 |
5 | 0.35 | 10 | 90 |
5.01 | 0.35 | 85 | 15 |
7 | 0.35 | 85 | 15 |
3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源 扫描方式：负离子扫描
电喷雾电压：-5500 v 雾化气压力：55 psi
气帘气压力：12 psi 辅助气压力：50 psi
离子源温度：550℃ 采集方式：多反应监测(mrm)
q1、q3均为单位分辨率
质谱参数(见表2)
(4) 实验结果
由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测己烯雌酚，加标量为2.5μg/kg、25.0μg/kg，回收率在80%~96%之间，rsd值在2.26%~8.95%之间，能够满足检测要求。由图1和图2可看出经cleanert pep-2固相萃取柱净化，采用venusil mp c18色谱柱检测得到的己烯雌酚峰形良好，且保留时间稳定。
图1 己烯雌酚样品加标2.5μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
图2 己烯雌酚样品加标25μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
结论：
本实验建立了己烯雌酚残留量的lc-ms/ms检测方法，并结合固相萃取技术对猪肉中己烯雌酚的残留量进行了测定。对于加标量为2.5μg/kg、25.0μg/kg的样品进行了检测，回收率在80%~96%，符合国标要求，固相萃取方法稳定并且色谱柱重现性良好，说明本方法能够用于检测动物源性食品中的己烯雌酚残留量。
(5) 订货信息：
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
venusil® mp c18 | 2.5μm,100å,2.1×50mm | va920502-0 |
cleanert® pep-2 | 500mg/6ml,30/pk | pe5006-2 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm和2.1×10mm | sh-100 |
直联式保护柱芯 | 2.5μm,100å,2.1×10mm | va920102-0s |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk | 1109-0519 |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫,45．shore a 1.0mm,100/pk | 0915-1819 |
针式过滤器(nylon) | 13mm,0.22μm,200/pk | as021320 |
一次性注射器 | 2ml两件式 无针头,100/pk | lzsq-2ml |
乙腈uv级 | 4l/瓶,色谱纯 | 015-4 |
正己烷hplc | 4l/瓶,色谱纯 | ah216-4 |
甲醇 | 4 l/瓶,色谱纯 | s230-4 |
己烯雌酚 | 标准品,100mg | gbw(e)060984 |
应用编号：af10034
