氟喹诺酮类(fluoroquinolones, fqs)，又称吡啶酮酸类，是近年来人工合成的一系列新型杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广，抗菌活性强，与其他抗菌药物无交叉，耐药性和毒副作用小等特点而广泛应用于动物和人类的多种感染性疾病的防治当中。氟喹诺酮类药物的残留除其本身的毒副作用对人体造成直接危害外，更为严重的是长期食用含较低浓度fqs药物的动物源性食品，容易诱导人类致病菌产生耐药性，具有潜在致畸致癌的威胁。中国和欧盟规定了在动物组织中其系列喹诺酮类兽药的最高残留量为10~90μg/kg。
(1) 样品提取
称取5.0g(精确到0.1g)均质好的样品，置于50ml离心管中，加入20ml 配置好的0.1mol/l的缓冲溶液，1000rpm涡旋混合1min，再超声提取10min，于8000rpm离心10min，重复提取三次，合并上清液做待净化液。
(2) 净化方法
先将cleanert® pep-2小柱分别用6ml甲醇和6ml水活化，然后将待净化液过柱(流速控制在2~3ml/min)，弃去滤液；再用3ml 5%甲醇水淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干；最后用6ml甲醇洗脱。收集洗脱液于40℃氮气吹干，用1ml 0.2%甲酸水溶液溶解残留物，过0.22μm滤膜后待测。
(3) 检测方法
3.1 色谱条件
色谱柱：venusil mp c18，2.1×50mm，5μm，100å；
流动相：a相-0.1%甲酸水溶液，b相-乙腈
柱 温：30℃；
进样量：10μl；
梯度洗脱：见表1
时间(min) | 流速 (ml/min) | a/% | b/% |
0 | 0.3 | 85 | 15 |
6 | 0.3 | 80 | 20 |
7 | 0.3 | 10 | 90 |
7.1 | 0.3 | 85 | 15 |
12 | 0.3 | 85 | 15 |
3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源 扫描方式：正离子扫描
电喷雾电压：5500 v 雾化气压力：45 psi
气帘气压力：15 psi 辅助气压力：40 psi
离子源温度：500℃ 采集方式：多反应监测(mrm)
q1、q3均为单位分辨率
定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞电压(见表2)
化合物 | q1 | q3 | ce/v |
诺氟沙星(norfloxacin) | 320.3 | 302.3 | 25 |
276.3 | 25 | ||
环丙沙星(ciprofloxacin) | 332.2 | 314.3 | 23 |
288.3 | 23 | ||
培氟沙星(pefloxacin) | 334.3 | 290.3 | 29 |
233.2 | 29 | ||
洛美沙星(lomefloxacin) | 352.3 | 265.2 | 27 |
308.3 | 27 | ||
恩诺沙星(enrofloxacin) | 360.3 | 316.4 | 27 |
342.3 | 27 | ||
氧氟沙星(ofloxacin) | 362.2 | 318.3 | 27 |
261.2 | 27 |
(4) 实验结果
由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测六种氟喹诺酮类药物，加标量为2.0μg/kg、20μg/kg、100μg/kg，回收率为70%~120%，能够满足检测要求。由图1-3可看出经cleanert pep-2固相萃取柱净化，采用venusilmp c18色谱柱检测能够使六种喹诺酮类药物得到良好的分离，且各种物质峰形良好，保留时间稳定。
物质名称 | 加标量/(μg/kg) | 处理加标回收率/% | rsd/% | rt/min |
诺氟沙星 | 2 | 78.77 | 0.15 | 3.26 |
(norfloxacin) | 20 | 84.95 | 0.12 | |
100 | 100.34 | 0.03 | ||
环丙沙星 | 2 | 87.98 | 0.08 | 3.79 |
(ciprofloxacin) | 20 | 71.63 | 0.11 | |
100 | 79.66 | 0.01 | ||
培氟沙星 | 2 | 86.21 | 0.08 | 3.57 |
(pefloxacin) | 20 | 83.65 | 0.15 | |
100 | 92.67 | 0.18 | ||
洛美沙星 | 2 | 101.39 | 0.07 | 4.34 |
(lomefloxacin) | 20 | 92.97 | 0.12 | |
100 | 108.73 | 0.04 | ||
恩诺沙星 | 2 | 94.27 | 0.03 | 5.02 |
(enrofloxacin) | 20 | 88.12 | 0.16 | |
100 | 93.05 | 0.05 | ||
氧氟沙星 | 2 | 102.73 | 0.08 | 3.23 |
(ofloxacin) | 20 | 103.91 | 0.15 | |
100 | 114.35 | 0.12 |
图1 氟喹诺酮类样品加标2.0μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
图2 氟喹诺酮类样品加标20μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
图3 氟喹诺酮类样品加标100μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
结论：
本实验建立了六种氟喹诺酮类药物的lc-ms/ms检测方法，并结合固相萃取技术对猪肉中氟喹诺酮类药物的残留量进行了测定。对于加标量为2μg/kg、20μg/kg、100μg/kg的样品进行了检测，回收率在70%~120%，符合国标要求，固相萃取方法稳定并且色谱柱重现性良好，说明本方法能够用于检测动物源性食品中的氟喹诺酮类药物残留。
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
venusil® mp c18 | 5μm,100å,2.1×50mm | va950502-0 |
cleanert® pep-2 | 200 mg/6 ml,30支/包 | pe2006-2 |
qdaura卓睿自动固相萃取仪 | 24通道 | spe-40 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm和2.1×10mm | sh-100 |
直联式保护柱芯 | 5μm,100å,2.1×10mm | va950102-0s |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk | 1109-0519 |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫,45．shore a 1.0mm,100/pk | 0915-1819 |
针式过滤器(nylon) | 13mm,0.22μm,200/pk | as021320 |
一次性注射器 | 2ml两件式 无针头,100/pk | lzsq-2ml |
乙腈uv级 | 4l/瓶,色谱纯 | 015-4 |
甲醇 | 4l/瓶,色谱纯 | s230-4 |
应用编号：af10036
