人工合成着色剂又称人工合成色素，常以苯、甲苯等为原料，先制备色素中间体，再将一种或两种中间体进行磺化、偶合、缩合和偶氮化等化学反应而制成。《食品中合成着色剂的测定》(gb/t 5009.35-2003)，采用聚酰胺吸附食品中的人工合成着色剂，并用乙醇胺溶液进行洗脱。聚酰胺对合成色素的吸附能力会受到温度的影响，实验时需对样品和淋洗液做加热处理，而且乙醇胺浓缩所需时间过长，此方法不适合大批量样品同时处理，且不易做自动化方法移植。
大多数人工合成着色剂均具有苯磺酸钠结构，本实验选用天津博纳艾杰尔科技的cleanert pwax 混合型弱阴离子交换柱和cleanert pa聚酰胺小柱，用以吸附食品中的合成着色剂，选用氨化甲醇洗脱，浓缩时间短，适用于大批量样品的同时检测。
(1) 样品溶液的配置
a) 乙酸铵溶液(0.02mol/l)：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000ml；
b) 甲醇/甲酸(6 4)溶液：量取甲醇60ml，甲酸40 ml，混匀；
c) 柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100ml溶解，混匀；
d) 无水乙醇-氨水溶液-水：量取无水乙醇70ml，氨水溶液20ml、水10ml，混匀；
e) 水(ph=6.0)：水加柠檬酸溶液调节ph=6.0；
(2) 样品提取
a) 饮料类样品：称取10g样品放入100ml烧杯中，含二氧化碳的样品加热去除二氧化碳；
b) 配制酒类：称取10g样品放入100ml小烧杯中，加热去除乙醇；
c) 液体调味料：称取10g样品放入100ml小烧杯中，若试样ph值偏高，用柠檬酸水溶液调节ph至6左右；
d) 固体调味料：称取2g样品放入100ml小烧杯中，加入10ml 1%氨水溶液，涡旋提取1min，4000r/min离心5min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水溶液调节ph至6左右作为待净化液；
e) 酱料类：称取2g样品，加入20ml石油醚，涡旋混合1min，5000r/min离心5min，弃去石油醚上清液，残渣吹干，加入10ml 1%氨水溶液，涡旋提取1min，4000r/min离心5min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水溶液调节ph至6左右作为待净化液；
f) 果冻、水果罐头：称取已均质样品2g，装入50ml离心管中，加入5ml乙醇/氨水溶液涡旋1min，4000r/min离心5min，重复提取至提取液无色，合并上清液置于80水浴中浓缩至2ml，水洗转移至10ml比色管中，用水定容(若试样ph偏高，用柠檬酸水溶液调节ph至6左右)；
g) 肉制品：称取已均质样品2g，装入50ml离心管中，加入20ml石油醚，涡旋混合1min，4000r/min离心5min，弃去石油醚上清液。残渣吹干，加入5ml乙醇/氨水溶液涡旋1min，4000r/min离心5min，重复提取至提取液无色，合并上清液置于80水浴中浓缩至2ml，水洗转移至10ml比色管中，用水定容(若试样ph偏高，用柠檬酸水溶液调节ph至6左右)转移至卓睿全自动固相萃取仪上样管中，待净化。
(3) 固相萃取柱净化
spe小柱：cleanert pwax(150mg/6ml)cleanert pa聚酰胺柱(1g/6ml)取以上两种固相萃取柱及上述提取液至qdaura卓睿全自动固相萃取仪中，完成spe净化过程：6ml甲醇，6ml水(ph值6~7)；全部提取液上样；6ml水(ph=4)、6ml甲醇-甲酸(6：4)、6ml水(ph值6~7)淋洗；
通入空气吹干小柱5min，6ml 2%氨化甲醇洗脱并接收，收集液于50℃氮气吹干，用1ml水定容，过0.45μm水系滤器过滤，待测。
(4) 实验条件
色谱柱：venusil® xbp c18 5μm 4.6×150mm；
流 速：1.0ml /min；
进样量：20μl；
波 长：254nm；
梯 度：
时间 | a%(0.02mol/l乙酸铵) | b%(甲醇) |
0 | 95 | 5 |
10 | 80 | 20 |
18 | 40 | 60 |
25 | 40 | 60 |
25.01 | 95 | 5 |
40 | 95 | 5 |
(5) 实验结果
5.1 cleanert pwax spe柱添加回收实验通过对不同基质样品的加标实验，对上述检测方法进行验证，结果见下表：
表3 5μg/g 红酒基质8 种着色剂加标回收率：
样品组分 | 标样过柱1(%) | 标样过柱2(%) | 红酒样品1(%) | 红酒样品2(%) |
柠檬黄 | 100.6 | 99 | 92.5 | 102 |
新红 | 100.6 | 97.8 | 102 | 100 |
苋菜红 | 101 | 98.5 | 104 | 105 |
靛蓝 | 89.8 | 88.8 | 86.9 | 87.5 |
胭脂红 | 100.3 | 98.8 | 92.5 | 90.2 |
日落黄 | 101 | 100 | 90 | 90.6 |
诱惑红 | 100 | 100 | 106 | 103 |
亮蓝 | 102 | 100 | 95 | 95 |
表4 1μg/g 火锅蘸料基质3 种着色剂加标回收率：
样品组分 | 标样过柱(%) | 添加样1(%) | 添加样2(%) | 添加样3(%) |
胭脂红 | 99.93 | 100.8 | 112.01 | 100.89 |
日落黄 | 98.02 | 100.31 | 99.15 | 101.87 |
诱惑红 | 100 | 89.68 | 90.11 | 88.16 |
5.2 cleanert pa spe柱添加回收实验
通过对不同基质样品的加标实验，对上述检测方法进行验证，结果见下表：
表5 5μg/g 红酒基质8 种着色剂加标回收率：
样品组分 | 标样过柱1(%) | 标样过柱2(%) | 红酒样品1(%) | 红酒样品1(%) |
柠檬黄 | 100.6 | 99 | 92.5 | 92.5 |
新红 | 100.6 | 97.8 | 102 | 102 |
苋菜红 | 101 | 98.5 | 104 | 104 |
靛蓝 | 89.8 | 88.8 | 86.9 | 86.9 |
胭脂红 | 100.3 | 98.8 | 92.5 | 92.5 |
日落黄 | 101 | 100 | 90 | 90 |
诱惑红 | 100 | 100 | 106 | 106 |
亮蓝 | 102 | 100 | 95 | 95 |
图1 8 种着色剂混标谱图( 从左至右依次为柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝)：
5.3赤藓红净化方法优化
赤藓红为苯甲酸钠结构，相对其他苯磺酸钠结构的着色剂，在spe小柱上保留较弱，国标《gb5009.35-2003》中赤藓红的前处理方法是和其他色素不一样的，采用的是液液萃取的方法。如按照2.2的净化方法操作，在淋洗阶段赤藓红将全部被洗脱下来。通过方法优化，最终淋洗方法确定为6ml水(ph值6~7)、6ml甲醇，选用cleanert pwax(150mg/6ml)，其他条件不变，可满足同时处理9种着色剂的实验要求。
5.4 cleanert pwax和cleanert pa相比具有的优势
a) 采用相同的前处理方法，方法无需调整；
b) 聚合物基底材料，提高了产品的吸附容量；
c) 小规格产品即可取得与大规格聚酰胺相同的实验效果，便于流速的控制和自动化方法移植。
表6 红酒中4种着色剂吸附容量考察：
pwax(150mg/6ml) | jxa(1g/6ml) | |
柠檬黄 | 不超过400ppm | 不超过100ppm |
苋菜红 | ||
胭脂红 | ||
日落黄 |
注意事项
1) 若提取液呈碱性，在上样之前要将其ph值调节至6左右，保证小柱可对合成着色剂有良好地吸附；
2) 若样品酒精度过高，建议在上样前对样品进行除醇处理；
3) spe小柱净化过程中，要注意对流速的控制，建议控制在1ml/min左右；
4) 洗脱液氮吹复溶后，应选用水系滤膜过滤，防止因滤膜吸附造成样品的损失，建议选用hydrophilic ptfe滤头
5.5 结论
实验结果表明，cleanert pwax或者cleanert pa和venusil xbp c18液相色谱柱可以用于食品中的合成着色剂的检测，该方法快速、准确。cleanert pwax spe小柱可同时处理9种着色剂，cleanert pa可同时处理8种着色剂。
(6) 订货信息：
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
qdaura 卓睿全自动固相萃取仪 | 4通道24位 | spe-40 |
lc-10f高效液相色谱仪 | 10ml/min,梯度系统,200-800nm双波长检测器 | fl-lc010gs |
cc-100分析型色谱柱温箱 | 温控范围：5-70℃；可安装1-2支300mm液相色谱柱 | cc-100 |
cleanert® pwax | 150mg/6ml, 30/pk | wa1506 |
cleanert pa | 1g/6ml, 30/pk | jxa0006 |
venusil xbp c18(l)液相色谱柱 | 4.6×150mm, 5μm, 150å | vx951505-l |
保护柱芯 | 4.6×10mm, 4/pk | vx950105-0 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm保护柱芯 | ch-100 |
针式过滤器(ptfe亲水) | 0.45μm, 直径13mm, 200/pk | as081345 |
一次性无针头注射器 | 2ml, 两件式, 100/pk | lzsq-2ml |
1.5ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm, 100/pk | 1109-0519 |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫,45.shore a 1.0mm,100/pk | 0915-1819 |
甲醇 | 4×4l/瓶 | ah230-4 |
应用编号：af10046
