皮革奶，是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品，加入到乳制品中的目的是提高产品蛋白含量。皮革水解蛋白本身对人体无害，但由于皮革水解蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，长期服用会导致重金属中毒。l-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特征性成份之一，而乳制品中的乳蛋白中不存在，故将l-羟脯氨酸的检测作为判定乳及乳制品中是否含有水解蛋白的依据。
本实验采用2,4-二硝基氟苯作为衍生剂，使用venusil® aa氨基酸分析专用柱对5种市售乳制品中的l-羟脯氨酸进行测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
agilent 1100高效液相色谱仪、agela technology 15位干式电模块氮吹仪；
试剂材料
色谱柱：venusil®aa；5 μm；4.6 × 250 mm；
l-羟脯氨酸标准品：白色晶体，纯度≥98%；2,4-二硝基氟苯：购自sigma 公司；屈臣氏蒸馏水；甲醇、乙腈为色谱纯；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、四水合硼酸钠、苯酚、浓盐酸均为分析纯；
水解液：6.0 mol/l 盐酸溶液(含1%苯酚)；
稀盐酸：0.1 mol/l 盐酸；
0.02mol/l 磷酸盐缓冲液：称取2.72g 磷酸二氢钾与4.56g 磷酸氢二钾，加1000ml水溶解，即得；
硼酸盐水溶液：准确称取 1.91 g 四水合硼酸钠，加50 ml 水溶解，混匀；
2,4-二硝基氟苯溶液：1% 的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液；
标准储备液：准确称取10 mg 标准品于10 ml 容量瓶中，用0.1 mol/l 盐酸溶解并定容至刻度，即得；
标准工作液：用0.1mol/l 盐酸稀释标准储备液至100 μg/ml；
测试对象：市售牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶。
样品处理
样品水解
准确称取样品 1.0 g(奶粉样品称取0.2 g) 样品，置于12 ml 棕色蛋白水解瓶中，加入8 ml 水解液，振摇使样品均匀分散于溶液中，然后将水解管置110 ± 1 ℃烘箱中水解24 小时，取出冷却，打开水解管，将水解液全部转移至20 ml 试管中,用0.1mol/l盐酸定容到刻度，混匀，过滤，取续滤液，作为衍生用样品溶液。
样品衍生
准确量取衍生用样品溶液 1.0 ml，置一玻璃管中，至氮吹仪中以50℃氮吹至干，残渣加1.0 ml 稀盐酸复溶，混匀，量取0.5 ml 置于5.0 ml 棕色瓶中，加入0.5ml 硼酸钠溶液，2,4 二硝基氟苯乙腈溶液0.5 ml，摇匀，于60 ℃烘箱中加热1 h，将试管于冷水浴中冷却，用0.02 mol/l 的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠混合溶液定容至2.0 ml。
l-羟脯氨酸标准曲线的绘制
用 l-羟脯氨酸标准工作液分别制成0.125、0.25、1.25、2.5、6.25 μg/ml 的系列浓度标准溶液，采用上述衍生方法，使用外标法定量，绘制标准曲线。
色谱条件
色谱柱：venusil®aa；5 μm；4.6 × 250 mm；
流速：1.0 ml/min；
柱 温：30 ℃；
波 长：360 nm；
进样量：20 μl；
流动相 a：0.02 mol/l 磷酸盐缓冲液；
流动相 b：乙腈︰甲醇=1︰1（v/v）；
梯 度：
表 1.梯度洗脱程序
时间/min | a/% | b/% |
0 | 83 | 17 |
14 | 85 | 15 |
20 | 85 | 15 |
22 | 70 | 30 |
26 | 83 | 17 |
30 | 83 | 17 |
结果与讨论
方法学考察
标准曲线及检出限
按照上述色谱条件，分别对l-羟脯氨酸系列标准溶液进样测试，l-羟脯氨酸在浓度0.125-6.25mg/l 范围内有较好的线性关系，回归方程为y=35.962x-0.2802；相关系数为0.9998，检出限（s/n=3）为0.8 mg/kg。
方法的精密度与回收率
精密度实验
在上述色谱条件下，使用 0.25 μg/ml 标准溶液连续进样6 次对仪器精密度进行测试，实验结果表明方法重复性好，结果见下表2。
表 2. 重复性试验数据
保留时间/min | 峰面积 | |
平均值 | 7.041 | 9.2 |
sd | 0.04 | 0.15 |
rsd/% | 0.58 | 1.61 |
市售乳制品检测及加标回收实验
按上述的处理方法，对 5 种市售乳制品(牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶) 分别进行加标实验，并计算回收率，加标浓度及回收率结果见表3，l-羟脯氨酸的加标平均回收率在85-110%之间，相对标准偏差小于6%，方法的回收率较好。
表 3. 市售乳制品中l-羟脯氨酸的相关回收率
市售乳制品 | 加标浓度(mg/kg) | 平均回收率/% | rsd/% |
奶粉 | 13 | 106.3 | 5.54 |
25 | 100.0 | 3.41 | |
125 | 109.3 | 0.54 | |
牛奶 | 2.6 | 94.4 | 3.37 |
5 | 100.0 | 1.14 | |
25 | 95.7 | 1.31 | |
乳品饮料 | 2.6 | 104.1 | 3.46 |
5 | 103.0 | 1.27 | |
25 | 102.1 | 1.06 | |
酸奶 | 2.6 | 85.4 | 3.76 |
5 | 95.8 | 2.47 | |
25 | 101.9 | 2.16 | |
大果粒酸奶 | 2.6 | 96.5 | 3.30 |
5 | 95.5 | 2.38 | |
25 | 98.1 | 1.58 |
图2.标准溶液1.25 μg/ml 高效液相色谱图(纵坐标局部放大图)
结论
根据实验结果，采用 venusil®aa 氨基酸分析专用柱，以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂测试乳制品中的l-羟脯氨酸，方法灵敏度高、重现性好，可用于判定乳制品中是否添加皮革水解蛋白。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil®aa氨基酸分析专用柱 | 4.6 × 250 mm，5 μm | 1 | aa952505-0 |
12 ml螺纹棕色样品瓶 | 66*18.5mm | 100/pk | 1509-1800 |
1.5ml棕色样品瓶 | 短螺纹棕色；带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | av1011-0 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a；1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | as021345-t |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
甲醇 | 4 l/瓶，色谱纯 | 4×4 l/箱 | ah230-4 |
乙腈 | 4 l/瓶，色谱纯 | 4×4 l/箱 | ah015-4 |
应用编号：af10093
