多不饱和脂肪酸是人体生长和健康所必须的物质，它们不仅是细胞结构的组成部分，还具有调节生理功能的重要意义，准确定量人血浆中多不饱和脂肪酸的含量对多种疾病的防治具有重要意义。而目前多不饱和脂肪酸较为先进及可靠的检测方法为lc-ms/ms法，但该检测方法容易受到血浆中的杂质如磷脂、蛋白质的影响，会产生基质增强或抑制效应。本应用提供一种可很好去除血浆中磷脂、蛋白质等干扰物质，且保证多不饱和脂肪酸具有良好回收率的净化方法。
多不饱和脂肪酸为含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的一类直链脂肪酸，为结构类似的一类化合物，本应用选用在生物体内含量较高，分布最广的多不饱和必需脂肪酸—花生四烯酸(ａａ)作为目标物，展示本应用方法的优越性。
目标物信息
图1 花生四烯酸结构图
材料及仪器
cleanert mas-m；cleanert m96 生物样品前处理仪；cleanert v96 氮吹浓缩仪；96孔接收板；ptfe过滤头；venusil asb c18（2.1*50mm，3μm，150å）；api 4000 。
样品处理方法
样品预处理
取100μl 3%氨水水溶液稀释100μl血浆样品，涡旋震荡1min保证混合均匀；（若为加标样，先将标准溶液加入至血浆中，并放置1h，再加入3%氨水水溶液进行稀释）
净化过程
将cleanert mas-m 96孔板放置于正压装置上，按以下步骤进行试验：
活化：甲醇 600μl，水 600μl；
上样： 将待净化液全部上样，上样液弃去
淋洗：水和甲醇各600μl，弃去。
洗脱：3%甲酸乙腈溶液600μl，使用接收板收集洗脱液，使用lc\ms\ms检测。（可将洗脱液进行浓缩氮吹，可获取更大的浓缩倍数）
仪器检测条件
hplc条件
色谱柱：venusil asb c18（2.1*50mm，3μm，150å）；
流速：200μl/min；
柱温：30℃；
进样量：5μl；
流动相：乙腈/水（75/25，v/v）
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离负模式
采集模式：多反应监测（mrm）
表1 质谱参数
化合物 | q1 | q3 | dp | ce |
花生四烯酸 | 303.0 | 259.1 | -109 | -18 |
303.0 | 230.9 | -85 | -29 | |
303.0 | 205.1 | -107 | -20 | |
303.0 | 177.1 | -90 | -30 |
结果
图2 500ppb标准溶液色谱图
图3 人血浆样品色谱图
图4 人血浆加标样色谱图（加标浓度为500ppb）
实验所用血浆中花生四烯酸的的含量约为2.9mg/l，计算加标回收率时需要扣除样品中目标物的含量。
表2 加标回收率及精密度数据
加标浓度/ppm | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 平均回收率 | rsd |
（n=8） | ||||||||||
0.5 | 109.2% | 101.3% | 105.6% | 107.3% | 116.3% | 112.4% | 114.6% | 112.2% | 109.9% | 4.5% |
2 | 100.1% | 92.6% | 96.3% | 96.7% | 110.2% | 108.7% | 109.2% | 103.4% | 102.2% | 6.6% |
结论
本实验采用cleanert mas-m 96孔板对血浆中花生四烯酸进行萃取净化，并用lc-ms/ms对萃取产物进行定量分析。结果表明该方法可用于日常对大量血浆样品中花生四烯酸进行高通量快速前处理，也可用于多不饱和脂肪酸研究工作。
订货信息表
产品名称 | 规格/包装 | 订货号 |
cleanert mas-m | 96孔板，50mg/2ml | ms-m-0502w |
cleanert v96 氮吹浓缩仪 | 与96孔板匹配 | nv96-g |
cleanert m96 生物样品前处理仪 | 与96孔板匹配 | spe-m96 |
96孔接收板 | 2ml/well，与96孔板匹配 | 96sp2036-y |
venusil asb c18 | 2.1*50mm，3μm，150å | vs930502-0 |
乙腈 | lc-ms级, 4*2.5l/箱 | lc015 |
水 | lc-ms级，4*2.5l/箱 | lc365 |
甲醇 | hplc, 4*4l | ah230-4 |
应用编号：yb10015
