前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
本实验采用venusil aa氨基酸分析方法包中的检测标准，使用venusil aa氨基酸分析专用柱对复方氨基酸注射液中的氨基酸组成进行了测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
试剂材料
流动相a：称取15.2 g无水醋酸钠，加水1850 ml溶解，用冰醋酸调节ph至6.5，然后加入乙腈140 ml，混匀；
流动相b：乙腈︰水=80︰20；
稀盐酸：0.1 mol/l盐酸；
二疏基二丙酸(mpa)溶液：取mpa约8.0 mg，加入200 mol/lnaoh溶液1ml溶解；
内标溶液：称取正亮氨酸10 mg，置于10 ml容量瓶中，加稀盐酸溶解并定容至刻度；
色氨酸：称取色氨酸10 mg，置于10 ml容量瓶中，加稀盐酸溶解并定容至刻度；
三乙胺乙腈溶液：取venusilraa氨基酸分析方法包中三乙胺一瓶，加乙腈8.6 ml，混匀；
异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取venusilraa氨基酸分析方法包中异硫氰酸苯酯溶液1瓶，加乙腈2.0 ml，混匀；
氨基酸标准溶液：取venusilraa氨基酸分析方法包中17种氨基酸标准溶液(包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、赖氨酸)1.0 ml，加色氨酸溶液0.5 ml，稀盐酸3.5 ml稀释，混匀；
复方氨基酸注射液样品：无色透明液体，由某医药科技公司提供。
样品制备
移取复方氨基酸注射液样品1.0 ml，置于50 ml离心管中，加入稀盐酸30 ml，混匀，作为样品溶液，待衍生使用。
氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生
取18种氨基酸标准溶液（含色氨酸2.5 μmol/ml）、上述复方氨基酸样品溶液各200 μl，分别置于1.5 ml离心管中，向每个离心管中加入mpa溶液 40 μl，再向每个离心管中加入内标溶液20 μl，混匀，然后依次向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，混匀，室温放置1小时。再向每个离心管中加入400 μl正己烷，振摇后放置10 min，取下层溶液200 μl，加800 μl水稀释，经0.45 μm针筒过滤器过滤，取续滤液作为样品试液。
色谱条件
色谱柱：venusil aa；5 μm；4.6 × 250 mm；
流 速：1.0 ml/min；
柱 温：40 ℃；
波 长：254 nm；
进样量：10 μl；
梯 度：
表1.液相色谱梯度洗脱条件
时间/min | a/% | b/% |
0 | 100 | 0 |
2 | 100 | 0 |
15 | 90 | 10 |
25 | 70 | 30 |
33 | 55 | 45 |
33.1 | 0 | 100 |
38 | 0 | 100 |
38.1 | 100 | 0 |
45 | 100 | 0 |
结果与讨论
本实验采用venusilraa氨基酸分析方法包对复方氨基酸注射液中氨基酸进行了测试，由表2及图2可知，使用venusilraa氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17种氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好。
表2. 复方氨基酸注射液中氨基酸测试结果
色谱峰序号 | 对照溶液 | 样品溶液 | ||
保留时间/min | 氨基酸名称 | 保留时间/min | 氨基酸名称 | |
1 | 4.494 | 门冬氨酸 | 4.457 | 门冬氨酸 |
2 | 5.244 | 谷氨酸 | — | — |
3 | 10.766 | 丝氨酸 | 10.716 | 丝氨酸 |
4 | 11.628 | 甘氨酸 | 11.531 | 甘氨酸 |
5 | 12.096 | 组氨酸 | 12.043 | 组氨酸 |
6 | 13.339 | 胱氨酸 | 13.277 | 胱氨酸 |
7 | 13.743 | 精氨酸 | 13.702 | 精氨酸 |
8 | 14.940 | 苏氨酸 | 14.883 | 苏氨酸 |
9 | 15.662 | 丙氨酸 | 15.599 | 丙氨酸 |
10 | 16.396 | 脯氨酸 | 16.356 | 脯氨酸 |
11 | 22.940 | 酪氨酸 | 22.956 | 酪氨酸 |
12 | 24.304 | 缬氨酸 | 24.310 | 缬氨酸 |
13 | 25.277 | 蛋氨酸 | 25.282 | 蛋氨酸 |
14 | 27.334 | 异亮氨酸 | 27.334 | 异亮氨酸 |
15 | 27.642 | 亮氨酸 | 27.635 | 亮氨酸 |
16 | 28.258 | 正亮氨酸 | 28.262 | 正亮氨酸 |
17 | 29.154 | 苯丙氨酸 | 29.162 | 苯丙氨酸 |
18 | 29.610 | 色氨酸 | 29.647 | 色氨酸 |
19 | 30.850 | 赖氨酸 | 30.861 | 赖氨酸 |
图1. 19种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图
图2. 复方氨基酸注射液供试品溶液高效液相色谱图
结论
根据实验结果，使用venusilraa氨基酸分析方法包共检测出复方氨基酸注射液中17种氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好，能够满足检测要求。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusilraa氨基酸分析方法包 | — | 1 | aa952505-k |
venusilraa氨基酸分析专用柱 | 4.6 × 250mm，5 μm | 1 | aa952505-0 |
异硫氰酸苯酯(pitc) | 25 μl | 10 | aa-d |
氨基酸标准溶液(含17种氨基酸) | 1 ml | 2 | aa-s |
正亮氨酸(nle) | 100 mg | 1 | aa-i |
三乙胺(tea) | 1.4 ml | 2 | aa-b |
色氨酸(trp)，单独订购 | 100 mg | 1 | aa-t |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫45°shore a；1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | as021345-t |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
应用编号：ap10037